发布部门: 国家食品药品监督管理局
发布文号: 国食药监许[2011]96号
1 范围
本方法规定了采用柱前衍生化液相色谱-紫外检测法测定化妆品中甲醛（cas ：50-00-0）的方法。
本方法适用于化妆品中甲醛含量的测定。
2 方法提要
甲醛测定采用柱前衍生化法，甲醛与2，4-二硝基苯肼反应生成黄色的2，4-二硝基苯腙（见图1），经高效液相色谱分离，紫外检测器在355 nm波长下检测，根据保留时间定性，峰面积定量，以标准曲线法计算含量。本方法对甲醛的检出限为0.01 µg，定量下限为0.052 µg。取0.2 g样品时，本方法对甲醛的检出浓度为0.001%，最低定量浓度为0.0052%。
图1 甲醛衍生化反应式（略）
3 试剂
除另有规定外，所用试剂均为分析纯，水为实验室用一级水。
3.1 甲醛标准物质水溶液。
3.2 2，4-二硝基苯肼，纯度 ≥ 99.0%。
3.3 三氯甲烷，色谱纯，含量 ≥ 99.9%。
3.4 盐酸（r20 =1.19 g/ml）。
3.5 氢氧化钠。
3.6 磷酸氢二钠（na2hpo4?12h2o）。
3.7 磷酸二氢钠（nah2po4?2h2o）。
3.8 乙腈，色谱纯。
3.9 甲醇，色谱纯。
3.10 去离子水。
3.11 2，4-二硝基苯肼盐酸溶液：称取2，4-二硝基苯肼（3.2） 0.20 g，置于锥形瓶中，先加浓盐酸（3.4）40 ml使溶解，必要时可超声助溶，再加去离子水（3.10）60 ml，摇匀，即得。
3.12 氢氧化钠溶液[c（naoh）= 1 mol/l]：称取naoh（3.5）10 g，加水适量溶解后，转移到250 ml量瓶中，用去离子水（3.10）稀释并定容至刻度，摇匀，即得。
3.13 磷酸缓冲溶液[c（po43-）0.5 mol/l]：精密称定nah2po4?2h2o（3.7）2.28 g和na2hpo4?12h2o（3.6）12.67 g，加水适量溶解后，转移到100 ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得。
3.14 乙腈水溶液（9＋1）：量取乙腈（3.8）180 ml，置锥形瓶中，加水20 ml，摇匀，即得。
3.15甲醛系列标准溶液：精密量取适量甲醛标准物质水溶液（3.1）置于10 ml量瓶中，加乙腈水溶液（3.14）稀释至刻度，摇匀，得质量浓度约为1.04 mg/ml的甲醛储备液，然后按照表1进行标准溶液的配制。
表1 甲醛系列标准溶液配制1）
注1）：甲醛储备溶液的初始浓度应以甲醛准物质水溶液的标示量计算。
4 仪器
4.1 高效液相色谱仪：具有紫外检测器。
4.2 分析天平：感量0.001 g。
4.3 超声波清洗仪。
4.4 离心机。
4.5 精密吸量管或精密移液器。
4.6 涡旋振荡器。
5 分析步骤
5.1 样品预处理
称取化妆品样品0.20 g（精确至0.001 g），置具塞刻度管中，加乙腈水溶液（3.14）至2 ml，涡旋2 min，使混匀，以5000 rpm转速离心5 min，精密量取上清液1 ml置5 ml 离心管中，加水2 ml，涡旋30 s，必要时以5000 rpm转速离心5 min，精密量取上清液1 ml置10 ml离心管中，加2，4-二硝基苯肼盐酸溶液（3.11）0.4 ml，涡旋1 min，静置2 min，加磷酸缓冲液（3.13）0.4 ml，再加氢氧化钠溶液（3.12）约1.9 ml调至中性，涡旋10 s，然后加入4 ml 三氯甲烷（3.3），涡旋3 min，以5000 rpm转速离心10 min，取三氯甲烷层溶液1 ml置离心管中，以5000 rpm转速离心10 min，取三氯甲烷层溶液，作为色谱分析待测液，备用。
5.2 色谱参考条件
色谱柱：c18色谱柱（250 × 4.6 mm，5 μm）；
流动相：甲醇＋水（60＋40）；
流速：1.0 ml/min；
柱温：25 ℃；
检测波长：355 nm；
进样体积：10 µl；
运行时间：25 min。
5.3 甲醛标准曲线待测溶液的制备
精密量取5.2 μg/ml、10.4 μg/ml、52 μg/ml、104 μg/ml、208 μg/ml、260 μg/ml系列标准工作溶液各1 ml置5 ml 离心管中，加水2 ml，涡旋30 s，必要时以5000 rpm转速离心5 min，然后精密量取上清液1 ml置10 ml离心管中，加2，4-二硝基苯肼盐酸溶液（3.11）0.4 ml，涡旋1 min，静置2 min，加磷酸缓冲液（3.13）0.4 ml，再加氢氧化钠溶液（3.12）约1.9 ml调至中性，涡旋10 s，然后精密加入4 ml 三氯甲烷（3.3），涡旋3 min，以5000 rpm转速离心10 min，取三氯甲烷层溶液1 ml置离心管中，以5000 rpm转速离心10 min，取三氯甲烷层，作为色谱分析待测液，备用。
5.4 测定
在“5.2”项色谱条件下，取“5.3”项下处理得到的标准曲线待测溶液分别进样，进行液相色谱分析，以系列标准溶液浓度为横坐标，甲醛衍生物2，4-二硝基苯腙的峰面积为纵坐标，进行线性回归，建立标准曲线，得到回归方程。取“5.1”项下处理得到的待测溶液进样10 μl，根据测定的甲醛衍生物2，4-二硝基苯腙的峰面积，代入标准曲线计算游离甲醛的质量浓度。按“7计算”，计算样品中游离甲醛的含量。
6 平行实验
按以上步骤操作，对同一样品独立进行测定获得的两次独立测试结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。
7 计算（略）
8 回收率和精密度
多家实验室验证的平均回收率为99.9% - 104%，相对标准偏差小于7%（n=6）。
9 色谱图（略）
发布文号: 国食药监许[2011]96号
1 范围
本方法规定了采用柱前衍生化液相色谱-紫外检测法测定化妆品中甲醛（cas ：50-00-0）的方法。
本方法适用于化妆品中甲醛含量的测定。
2 方法提要
甲醛测定采用柱前衍生化法，甲醛与2，4-二硝基苯肼反应生成黄色的2，4-二硝基苯腙（见图1），经高效液相色谱分离，紫外检测器在355 nm波长下检测，根据保留时间定性，峰面积定量，以标准曲线法计算含量。本方法对甲醛的检出限为0.01 µg，定量下限为0.052 µg。取0.2 g样品时，本方法对甲醛的检出浓度为0.001%，最低定量浓度为0.0052%。
图1 甲醛衍生化反应式（略）
3 试剂
除另有规定外，所用试剂均为分析纯，水为实验室用一级水。
3.1 甲醛标准物质水溶液。
3.2 2，4-二硝基苯肼，纯度 ≥ 99.0%。
3.3 三氯甲烷，色谱纯，含量 ≥ 99.9%。
3.4 盐酸（r20 =1.19 g/ml）。
3.5 氢氧化钠。
3.6 磷酸氢二钠（na2hpo4?12h2o）。
3.7 磷酸二氢钠（nah2po4?2h2o）。
3.8 乙腈，色谱纯。
3.9 甲醇，色谱纯。
3.10 去离子水。
3.11 2，4-二硝基苯肼盐酸溶液：称取2，4-二硝基苯肼（3.2） 0.20 g，置于锥形瓶中，先加浓盐酸（3.4）40 ml使溶解，必要时可超声助溶，再加去离子水（3.10）60 ml，摇匀，即得。
3.12 氢氧化钠溶液[c（naoh）= 1 mol/l]：称取naoh（3.5）10 g，加水适量溶解后，转移到250 ml量瓶中，用去离子水（3.10）稀释并定容至刻度，摇匀，即得。
3.13 磷酸缓冲溶液[c（po43-）0.5 mol/l]：精密称定nah2po4?2h2o（3.7）2.28 g和na2hpo4?12h2o（3.6）12.67 g，加水适量溶解后，转移到100 ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得。
3.14 乙腈水溶液（9＋1）：量取乙腈（3.8）180 ml，置锥形瓶中，加水20 ml，摇匀，即得。
3.15甲醛系列标准溶液：精密量取适量甲醛标准物质水溶液（3.1）置于10 ml量瓶中，加乙腈水溶液（3.14）稀释至刻度，摇匀，得质量浓度约为1.04 mg/ml的甲醛储备液，然后按照表1进行标准溶液的配制。
表1 甲醛系列标准溶液配制1）
| 工作溶液 | 溶液初始浓度 | 量取体积 | 定容终体积 | 标准工作溶液终浓度 |
| 储备溶液 | 10.4 mg/ml | 1 ml | 10 ml | 1.04 mg/ml |
| 标准溶液1 | 1.04 mg/ml | 2.5 ml | 10 ml | 260 μg/ml |
| 标准溶液2 | 1.04 mg/ml | 2 ml | 10 ml | 208 μg/ml |
| 标准溶液3 | 1.04 mg/ml | 1 ml | 10 ml | 104 μg/ml |
| 标准溶液4 | 104 μg/ml | 5 ml | 10 ml | 52.0 μg/ml |
| 标准溶液5 | 104 μg/ml | 1 ml | 10 ml | 10.4 μg/ml |
| 标准溶液6 | 10.4 μg/ml | 5 ml | 10 ml | 5.2 μg/ml |
注1）：甲醛储备溶液的初始浓度应以甲醛准物质水溶液的标示量计算。
4 仪器
4.1 高效液相色谱仪：具有紫外检测器。
4.2 分析天平：感量0.001 g。
4.3 超声波清洗仪。
4.4 离心机。
4.5 精密吸量管或精密移液器。
4.6 涡旋振荡器。
5 分析步骤
5.1 样品预处理
称取化妆品样品0.20 g（精确至0.001 g），置具塞刻度管中，加乙腈水溶液（3.14）至2 ml，涡旋2 min，使混匀，以5000 rpm转速离心5 min，精密量取上清液1 ml置5 ml 离心管中，加水2 ml，涡旋30 s，必要时以5000 rpm转速离心5 min，精密量取上清液1 ml置10 ml离心管中，加2，4-二硝基苯肼盐酸溶液（3.11）0.4 ml，涡旋1 min，静置2 min，加磷酸缓冲液（3.13）0.4 ml，再加氢氧化钠溶液（3.12）约1.9 ml调至中性，涡旋10 s，然后加入4 ml 三氯甲烷（3.3），涡旋3 min，以5000 rpm转速离心10 min，取三氯甲烷层溶液1 ml置离心管中，以5000 rpm转速离心10 min，取三氯甲烷层溶液，作为色谱分析待测液，备用。
5.2 色谱参考条件
色谱柱：c18色谱柱（250 × 4.6 mm，5 μm）；
流动相：甲醇＋水（60＋40）；
流速：1.0 ml/min；
柱温：25 ℃；
检测波长：355 nm；
进样体积：10 µl；
运行时间：25 min。
5.3 甲醛标准曲线待测溶液的制备
精密量取5.2 μg/ml、10.4 μg/ml、52 μg/ml、104 μg/ml、208 μg/ml、260 μg/ml系列标准工作溶液各1 ml置5 ml 离心管中，加水2 ml，涡旋30 s，必要时以5000 rpm转速离心5 min，然后精密量取上清液1 ml置10 ml离心管中，加2，4-二硝基苯肼盐酸溶液（3.11）0.4 ml，涡旋1 min，静置2 min，加磷酸缓冲液（3.13）0.4 ml，再加氢氧化钠溶液（3.12）约1.9 ml调至中性，涡旋10 s，然后精密加入4 ml 三氯甲烷（3.3），涡旋3 min，以5000 rpm转速离心10 min，取三氯甲烷层溶液1 ml置离心管中，以5000 rpm转速离心10 min，取三氯甲烷层，作为色谱分析待测液，备用。
5.4 测定
在“5.2”项色谱条件下，取“5.3”项下处理得到的标准曲线待测溶液分别进样，进行液相色谱分析，以系列标准溶液浓度为横坐标，甲醛衍生物2，4-二硝基苯腙的峰面积为纵坐标，进行线性回归，建立标准曲线，得到回归方程。取“5.1”项下处理得到的待测溶液进样10 μl，根据测定的甲醛衍生物2，4-二硝基苯腙的峰面积，代入标准曲线计算游离甲醛的质量浓度。按“7计算”，计算样品中游离甲醛的含量。
6 平行实验
按以上步骤操作，对同一样品独立进行测定获得的两次独立测试结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。
7 计算（略）
8 回收率和精密度
多家实验室验证的平均回收率为99.9% - 104%，相对标准偏差小于7%（n=6）。
9 色谱图（略）
